SC∕T 7223.3-2017 黏孢子虫病诊断规程 第3部分：武汉单极虫(水产)
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文件大小(MB)： |
0.35 |
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页数： |
10 |
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日期： |
2021-12-25 |
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ICS 65.020.30,B 41 4H,中华人民共和国水产行业标准,SC/T 7223.3一2017,黠子包子虫病诊断规程,第3 部分:武汉单极虫,Protocols for diagnosis of myxosporidiosisPart,3: Disease caused by Thelohanellus wuhanensis,2017 -06-12 发布2017 -1 0-01 实施,导二二t咱中华人民共和国农业部发布,SCjT 7223. 3一2017,ι~,剧昌,SCj T 7223(( 黠抱子虫病诊断规程》拟分为如下部分:,一一第1 部分: 洪湖腆泡虫;,一一第2 部分:吴李腆泡虫;,一一第3 部分:武汉单极虫;,一一第4 部分:吉陶单极虫,本部分为SCj T 7223 的第3 部分,本部分按照GBj T 1. 1-2009 给出的规则起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任,本部分由农业部渔业渔政管理局提出,本部分由全国水产标准化技术委员会(SACj TC 156) 归口,本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所,本部分主要起草人: 李文样、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明,I,范围,本部分给出了饵CCaras sius,汉单极虫( Thelohanellus,汉单极虫病的综合判定,本部分适用于挪,2,下列文件对,件。凡是不注,GBj T 6,SCj T 7,3,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5 上游引,下游引,本对引,3.6 DNA,3. 7 其他试剂见附,4 仪器和设备,4. 1 解剖盘、剪刀、慑子、解,4. 2 体视显微镜和带测微标尺的,4. 3 盖玻片、载玻片和培养皿,4. 4 电子天平,蒙古子包子虫病诊断规程,第3 部分:武汉单极虫,4. 5 普通台式离心机和高速冷冻离心机,4.6 普通冰箱,4. 7 微量移液器,4.8 PCR 扩增仪,4. 9 离心管和PCR 管,4. 10 紫外透射仪或凝胶成像系统,SCj T 7223. 3-2017,抱子虫病" ) 的临床症状，规定了武,和分子检测的方法，以及武,1,SCjT 7223. 3-2017,4. 11 水平电泳系统,5 感染对象与临床症状,5. 1 感染对象,武汉单极虫感染侧,5. 2 临床症状,武汉单极虫一般寄生于僻的体表鳞片下组织和鳝条，寄生于鳞片下的危害较大，可导致鱼苗的死,亡。病鱼鳞片被包囊顶起，形成椭圆形凸起,6 武汉单极虫的采集、固定与标本制作,6. 1 病鱼采集,观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符,合SCj T 7103 的规定,6.2 样晶的采集,在鳞片隆起处，用慑子取下鳞片，然后将包囊移出，置于培养皿中,6. 3 样品的固定,用10% 中性福尔马林溶液(见A.l)固定蒙古抱子虫包囊团或抱子，或用100% 乙醇保存,6.4 样晶的标本制作,将茹抱子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液(见A. 2) ，盖上盖玻,片，用于显微镜观察,7 武汉单极虫的鉴定,7. 1 武汉单极虫形态学鉴定,包囊近球形，乳白色，表面有黑色斑点。根据显微镜内的测微标尺测量抱子和极囊的大小，武汉单,极虫抱子的形态特征见附录B。成熟抱子壳面观为梨形，缝面观呈厚梭形，前端略尖，后端钝圆，薄膜鞠,仅包围抱子后部，亮瓣底部有1 个~4 个"V"形榴皱;抱子长2 1. 0 f.lm~25. 0 μm ，宽12. 0 μm~15. 0 μm ,厚10.0 μm~12. 5μm; 极囊1 个，近球形，极囊长9 . 0 μm~12. 3μm ，宽7.0 μm~9. 7μm; 极丝盘成,8 圈~10 圈,如果抱子的形态特征与上述描述相符，则可判定为疑似武汉单极虫,7. 2 武汉单极虫分子检测,7.2. 1 虫体DNA 的提取,将用100% 乙醇固定的抱子(有包囊的用清水冲洗，去除表面组织)充分干燥去除乙醇，置于1. 5 mL,的离心管中，加人0.5mL 裂解缓冲液(见A. 6) ， 55 0C 下过夜。冷却至室温后，加人500μLDNA 抽提缓,冲液(见A. 7) ，摇匀， 5200 g 离心10 min ，收集上清液。然后加人O . 1 倍体积的乙酸纳缓冲液(见A. 3),和2 倍上清液体积的一20 0C 预冷无水乙醇， 4 0C下10000 g 离心10min 弃上清液，用70% 乙醇洗涤沉淀,2 次，弃上清液，空气干燥后溶于40μLTE 缓冲液(见A.的中，一20 0C 保存备用,7. 2. 2 18S rDNA 的PCR 扩增,在50μL 的PCR 反应体系中，包含模板基因组DNA 10 ng~50 ng、1. 5UTα， q 酶、1. 5 mmol/ L 的,MgC12 、0.2 mmo l/ L 的dNTPs、上游引物和下游引物各2μmol/ L 、Taq 酶缓冲液5μL。无加热盖的,PCR 仪应滴加少许矿物油,在PCR 扩增仪中， 95 0C 预变性5 min ，再95 0C 50 s?56 0C 50 s?720C 1 min ，共35 个循环;最后,72 0C延伸10 min ,SC/T 7223. 3-2017,PCR 扩增时，应设置阴性对照(无虫体DNA 模板)和阳性对照(含武汉单极虫DNA 模板) ,7. 2.3 PCR 产物电泳与测序,取5μLPCR 产物，加人1μL 澳酣蓝指示剂溶液(见A. 10) ，混匀，用1. 0% 琼脂糖凝胶(含O . 05,μL/ mL ……
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